Ogromen (resnično ogromen) uspeh je tehnika, ki celice povečuje do orjaških razsežnosti, da bi razkrili najmanjše podrobnosti. Strokovnjaki uporabljajo polimer, podoben superabsorbentnim materialom v plenicah, s katerim prostornino bioloških vzorcev povečajo na milijardkratnik prvotne – v vsaki dimenziji za 1000-krat. S tolikšnim »napihovanjem« bi lahko eno samo celico povečali na velikost mišjih možganov, vzorec velikosti drobiža pa na velikost olimpijskega bazena.
S to tehniko lahko strokovnjaki s pomočjo običajnih svetlobnih mikroskopov preslikajo položaj aminokislin (gradnikov beljakovin) v beljakovinah in majhnih molekulah, imenovanih peptidi. Metodo so opisali v predobjavi na strani bioRxiv, objavljeni v začetku meseca, v članku. Prej so tako podrobno opazovanje molekul običajno dosegali z dragimi in zapletenimi tehnikami, na primer s krioelektronsko mikroskopijo (cryo-EM) in rentgensko kristalografijo.
»To je demokratizacija strukturne biologije«
– pravi soavtor študije Silvio Rizzoli, nevroznanstvenik in strokovnjak za slikanje z Univerzitetnega medicinskega centra v Göttingenu (UMG). »To resnično omogoča temeljni opis bistva beljakovine,« dodaja eden od soavtorjev, Helena Hu, biološka inženirka z Massachusetts Institute of Technology (MIT).
Ekspanzijska mikroskopija
Zakoni fizike omejujejo optično ločljivost svetlobnih mikroskopov: predmetov, ki so med seboj oddaljeni manj kot približno 200 nanometrov, ni mogoče ločiti. Tehnike »superločljive« svetlobne mikroskopije, ki se običajno opirajo na optične trike in drago opremo, so to mejo ločljivosti znižale pod 10 nm.
Leta 2015 so Edward Boyden, nevroinženir z MIT in soavtor študije, in njegovi sodelavci razvili alternativno metodo, s katero je mogoče z običajnimi fluorescenčnimi svetlobnimi mikroskopi doseči izjemno visoko ločljivost. Raziskovalci so s pomočjo nabrekajočega hidrogela prostornino vzorcev tkiva povečali približno štirikrat v vseh smereh. Tako so se celične komponente oddaljile druga od druge, kar je izboljšalo ločljivost.
Od takrat so raziskovalci Boydnovo metodo, imenovano »ekspanzijska mikroskopija«, nenehno izboljševali, tako da so vzorce napihnili na vse večjo prostornino, vendar se je zdelo, da je raztezanje običajno izvedljivo le do približno 20-kratne povečave. Da bi dosegli še večjo velikost, so raziskovalci razvili nov recept za hidrogel, s katerim so vzorce razširili še bolj. Ekipa je uporabila tudi ekspanzijsko mikroskopsko metodo, imenovano ONE mikroskopija, za preslikavo beljakovinskih struktur s svetlobnim mikroskopom.
Očiščene beljakovine so vezali na hidrogel, nato pa jih z encimi ali toploto razgradili, tako da jih je bilo mogoče raztegniti ob ohranitvi prostorske strukture.
Orjaške beljakovine
Pri tako doseženem 1000-kratnem raztezanju so raziskovalci označili več od devetih aminokislin, ki sestavljajo peptid mCLING. Nato so z fluorescenčnim mikroskopom posneli medsebojni položaj gradnikov. Meritve so se ujemale s strukturami mCLING, dobljenimi iz računalniških simulacij.
Metoda je razkrila tudi strukturo beljakovine, imenovane nanotelo (pomanjšana različica protitelesa), in položaj nekaterih njenih aminokislin. Poleg tega so raziskovalci s to tehniko preslikali tudi že prej določeno strukturo zelenega fluorescenčnega proteina (GFP), ki je eno temeljnih orodij v biotehnologiji za označevanje drugih beljakovin.
Raziskovalci ocenjujejo, da njihov model GFP, rekonstruiran iz več tisoč posnetkov, dosega ločljivost približno 1,2 nm, torej 12 ångströmov. To zaostaja za strukturo GFP z ločljivostjo 1,9 ångströma, določeno z rentgensko kristalografijo, ki je na voljo v javnih repozitorijih, in za ravnjo podrobnosti, ki jo strokovnjaki redno dosegajo s krioelektronskimi mikroskopskimi preiskavami.
Kot pa pojasnjuje Ali Shaib, strokovnjak za nanoskope pri UMG in soavtor študije, so jim zaradi metodoloških izboljšav v še neobjavljenem poskusu ločljivost očiščenih beljakovin uspelo znižati pod 10 ångströmov. Rizzoli omenja, da je ekipa zdaj že sposobna z ločljivostjo približno 10 ångströmov določiti tudi obliko beljakovin, ki so še znotraj celic.
»Prizadevamo si, da bi s cenovno dostopnimi optičnimi mikroskopi ustvarili posnetke, podobne tistim s krioelektronskih mikroskopov«
– pravi Shaib.
Rizzoli pa poudarja, da je treba tehnike, kot je mikroskopija s 1000-kratno povečavo, presojati glede na to, kakšne biološke informacije lahko razkrijejo. »Mislim, da ni pomembna le ločljivost, temveč tudi to, kaj je z njo mogoče videti.«
Cenejša mikroskopija?
Prejšnje tehnike superločljive svetlobne mikroskopije so omogočale ločljivost na ravni ångströmov, pravi Lothar Schermelleh, strokovnjak za slikanje z Univerze v Oxfordu, vendar je strukturna informacija, ki jo te metode nudijo, omejena. »Ta raziskava spreminja vse. Opazovanje GFP je preprosto fantastično,« pravi strokovnjak.
Kirti Prakash, računski biolog z Univerze Ruskin, je skeptičen glede tega, ali vzorci, povečani 1000-krat v posameznih dimenzijah, res ohranijo svoje prvotne lastnosti, in meni, da bi bilo treba strukturne podrobnosti, objavljene v študiji, potrditi tudi z drugimi metodami. »To je zelo kul, razburljiv rezultat. A osebno menim, da niso razkrili novih bioloških dejstev,« pravi.
Milijardkratna povečava bioloških vzorcev prinaša očitne izzive. Pri takih velikostih lahko že srednje velike beljakovine zapolnijo celotno vidno polje mikroskopa, pravi John Danial, raziskovalec eksperimentalne fotonike z Univerze St Andrews. Zaradi visoko ločljivih struktur je treba številne delce »povprečiti«, zato morajo raziskovalci za rekonstrukcijo ene same beljakovinske strukture zbrati veliko količino slik, pojasnjuje strokovnjak.
Po besedah Hu se tehnika lahko uporablja skupaj z avtomatiziranim slikanjem: kaže, da geli več dni ohranijo velikost, ne da bi se skrčili. S tehniko je poleg tega mogoče slikati tudi beljakovine, ki so premajhne za krioelektronsko mikroskopsko preiskavo, dodaja.
Danial kljub temu upa, da bodo tehnike svetlobne mikroskopije, kot je 1000-kratna povečava, ponudile nove strukturne vpoglede v beljakovine in druge biomolekule, in meni, da bi te metode lahko zmanjšale ekonomske omejitve strukturne biologije. V Afriki na primer deluje le en sam objekt s krioelektronskim mikroskopom. Kot pravi raziskovalec:
»Z mikroskopom za pet do deset tisoč dolarjev bi lahko beljakovine posneli na strukturni ravni. Takšni mikroskopi pa so na voljo tudi tam, kjer krioelektronski mikroskopi niso dosegljivi.«
